TA克隆

TA克隆實(shí)驗(yàn)原理　

  TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3 一5外切酶的校準(zhǔn)活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)3 末端加上未配對(duì)的單一A凸出尾 ，質(zhì)粒載體提供線性3末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

只需4個(gè)步驟：①擴(kuò)增目的PCR產(chǎn)物；②制備T克隆載體；③PCR產(chǎn)物直接克隆至T載體上④轉(zhuǎn)化并篩選重組子。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與T載體的連接

取1只無菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產(chǎn)物約0.3 pmol

T載體約0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3－10倍。

*2 相同末端的載體與DNA進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。

（2）蓋好蓋子，用手指輕彈Ep管數(shù)次，并于臺(tái)式離心機(jī)離心2s 以集中溶液。

（3）將反應(yīng)管放入4℃金屬浴中反應(yīng)20h。

（4）取出約2ul的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結(jié)果，與未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

（5）用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul，使用10ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

（6）通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。