上海基屹為您解析RNAi抗干擾檢測

上海基屹為您解析RNAi抗干擾檢測

一．RNAi的發(fā)現(xiàn)
 
     早在1990 年進行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時偶然發(fā)現(xiàn),將全長或部分基因?qū)胫参锛毎竽承﹥?nèi)源性基因不能表達,但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無任何影響,并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默（posttranscriptional gene silencing ,PTGS） . 1996 年在脈孢菌屬（Neurospora） 中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,只不過將這種現(xiàn)象命名為基因表達的阻抑作用（quelling） . 發(fā)現(xiàn)dsRNA 能夠?qū)е禄虺聊木€索來源于線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo 和Kemphues 嘗試用反義RNA 去阻斷par－1 基因的表達以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達,但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對照,也同樣阻斷了基因的表達。這個奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello 將雙鏈dsRNA ——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默。實際上每個細胞只要很少幾個分子的雙鏈RNA 已經(jīng)足夠*阻斷同源基因的表達。后來的實驗表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達,還會導(dǎo)致其*代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA 干擾。
 
     過去認為, 哺乳動物細胞中不存在RNAi 現(xiàn)象,因為較長的dsRNA 在哺乳動物細胞中能誘導(dǎo)IFN（干擾素） 生成,并激活STAT 途徑參與的PKR（dsRNA 依賴性激酶） 的轉(zhuǎn)錄,同時dsRNA 本身與PKR 結(jié)合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙;另一方面,dsRNA 又能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成   2′,5′腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發(fā)生非特異性的RNA 降解效應(yīng)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn), 只要dsRNA 短于30bp ,就不會促發(fā)干擾素效應(yīng),同時又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說明dsRNA 在哺乳動物細胞中也能發(fā)揮一定作用,為以后的基因治療等RNAi 應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的研究方向。 
 
二．RNAi的作用機制
 
     近年來研究發(fā)現(xiàn),干擾性小RNA（ small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA） 是RNA 干擾作用（RNAi） 賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子. siRNA 是一類長約21～25 個核苷酸（ nt ） 的特殊雙鏈RNA（dsRNA） 分子,具有特征性結(jié)構(gòu),即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基. 此外,每條單鏈的3′端均有2～3 個突出的非配對的堿基RNAi 的主要過程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干擾性小RNA （ siRNA） ,由siRNA 介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細胞中dsRNA的形成是RNAi 的*步. 細胞中dsRNA 可通過多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA ;病毒RNA 復(fù)制中間體;以及以細胞中單鏈RNA 為模板由細胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRp） 催化合成dsRNA等. 在線蟲（ C. elegans） 可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養(yǎng)表達正義和反義RNA 的細菌獲得dsRNA。
 
     現(xiàn)已初步闡明RNAi 的作用機制. RNAi 的*步是,dsRNA 在內(nèi)切核酸酶（一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶） 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為Dicer. Dicer 含有解旋酶（helicase） 活性以及dsRNA 結(jié)合域和PAZ 結(jié)構(gòu)域. 已發(fā)現(xiàn)在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動物中也存在Dicer 同類物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體,該核蛋白體稱為RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（ RNA induced silencing complex , RISC） , 由RISC 介導(dǎo)切割靶mRNA 分子中與siRNA 反義鏈互補的區(qū)域,從而達到干擾基因表達作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲C. elegans中的MUT7（一種RNase D樣蛋白） 可能是一種3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源。
 
     的研究進一步揭示,ATP 在siRNA 介導(dǎo)的RNAi 中具有重要作用. 較長dsRNA 向siRNA 的轉(zhuǎn)變要有ATP 參與. siRNA 與蛋白因子形成一個無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 復(fù)合體;隨之, siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRNA 復(fù)合體（RISC） ,此步具有ATP 依賴性. RISC 活性復(fù)合體對靶mRNA 的識別和切割作用,這一步可能不需ATP參與。
 
     此外,ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對siRNA 的功能具有重要作用. 上述過程中siRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變,因為siRNA 雙鏈體與細胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它輔助因子,含有siRNA 的活性復(fù)合體仍能識別和切割靶mRNA 分子。
 
     siRNA 可作為一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶（RdRp） 作用下以靶mRNA 為模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可進入上述循環(huán). 這種過程稱為隨機降解性多聚酶鏈反應(yīng)（random degradative PCR） . 新生的dsRNA 反復(fù)合成和降解,不斷產(chǎn)生新的siRNA ,從而使靶mRNA 漸進性減少,呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象. RdRp 一般只對所表達的靶mRNA 發(fā)揮作用,這種在RNAi 過程中對靶mRNA 的特異性擴增作用有助于增強RNAi的特異性基因監(jiān)視功能. 每個細胞只需要少量dsRNA 即能*關(guān)閉相應(yīng)基因表達,可見RNAi 過程具有生物催化反應(yīng)的基本動力學(xué)特征。
 
     miRNA 與siRNA 的區(qū)別：
 miRNA是單鏈的，而siRNA則是雙鏈的；
miRNA參與正常情況下生長發(fā)育基因調(diào)控，而siRNA不參與動物體的正常生長，只有在病毒或其它dsRNA誘導(dǎo)情況下才產(chǎn)生siRNA,作為miRNA的*和補充；
 miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，推測在翻譯水平也起作用，而siRNA為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達調(diào)控；
Dicer酶對兩類RNA的加工過程，miRNA為不對稱性，僅來自含莖－環(huán)結(jié)構(gòu)RNA前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解，而這種不對稱性不存在于而siRNA加工過程中。